A tárolási módszerek és fejlődésük

A cornea laboratóriumokban a corneák tárolásának rövid, közép és hosszú távú módjai ismertek.

1.1. A rövidtávú módszer legkorábban alkalmazott változata az egész donor szem párakamrában, +4°C-on történő tárolása a szaruhártya beültetésének időpontjáig. Eközben az endothelsejtek progresszív pusztulását (autolysis) mutatták ki, elsősorban a csarnokvízben létrejövő post mortem változások miatt. E sejtpusztulás főleg az első 24 óra után kezd jelentkezni, ezért a legtöbb esetben az így tárolt corneák 48 órán belül beültetésre kerültek. Napjainkban már csak a szaruhártyák 1%-át tárolják így.
1.2. A rövidtávú módszer később kialakított változata már a szaruhártya izolált tárolása volt szövettenyésztéssel. Így +4°C-on 4 napig lehetett életben tartani a corneákat. Ezt a módszert 1974-ben McCarey és Kaufman vezette be az Egyesült Államokban, ezért ezt a TC-199 alapú tápoldatot, mint MK tápoldatot tartja számon a szakirodalom. 1978-ban Waltham és Palmberg az eredeti MK tápoldatot a stabil pH kialakítása céljából HEPES puffer hozzáadásával módosították.

2. A középtávú tárolással a corneákat maximum 14 napig lehet életben tartani, szintén +4°C-on. Ezt a módszert 1984-ben Lindstrom és Kaufman vezették be. Az itt használt oldat tulajdonképpen a megfelelő ozmotikus közeg kialakítása céljából chondroitin szulfáttal kiegészített MK tápoldat, ezért MMK tápoldatnak (Modified McCarey Kaufman) is nevezik. Később egyre újabb - már MEM alapú - középtávú tárolásra alkalmas tápoldatok (pl. Dexsol, Optisol, stb.) jelentek meg, melyek elsősorban az Egyesült Államokban terjedtek el.
A mai középtávú tárolóoldatokkal 2-3 hétig lehet életben tartani a corneákat, Európában a szaruhártyák 20%-át tárolják így.

3. A hosszú távú módszerrel +31°C-on rutinszerűen 30 napig tárolhatjuk a corneákat. Az eljárást 1972-ben kezdték kidolgozni az Egyesül Államokban, a Minnesota Egyetemen. Szemben a korábbi oldatokkal ez már nem TC-199 alapú tápoldat, hanem Minimum Essential Medium alapú, melyhez L-glutamint, fötális borjú savót és chondroitin szulfátot adtak. Eleinte 5%-os CO2 atmoszférában, 2-3 naponkénti tápoldat cserével volt lehetséges a tárolás ezzel az oldattal. 1979-ben Sperling és munkatársai Dániában továbbfejlesztették ezt a technikát, és zárt rendszer alkalmazásával elérték, hogy a tápoldatot csak hetente kellett cserélni. Dextran hozzáadásával pedig a nem kívánatos ödémákat is csökkentették.
Napjainkban az Európában tárolt corneák túlnyomó többsége (80%) ezzel az azóta továbbfejlesztett módszerrel kerül tárolásra, már tápoldat csere nélkül.

4. A hosszú távú tárolás egy másik módja a cryopreservatio, a corneák fagyasztása. Az első sikeres keratoplasztikát fagyasztott corneával 1954-ben Eastcott és munkatársai végezték. Később Müller és mts. (1964) majd Kaufman és mts. (1966) is beszámoltak sikeres keratoplasztikákról fagyasztott cornea felhasználásával. Mivel ez a módszer nehézkes és drága is, valamint csak kb. 70%-os volt a beültetések sikere, ezért bár az endothelsejtek túlélik a fagyasztást, mégsem terjedt el a cryopreservált szaruhártyák használata a gyakorlatban.

A Cornea Bank Budapest laboratórium közép és hosszútávú tárolóoldatokat is használ, hogy a megfelelő tárolási módszert alkalmazva igazodjon a műtéti időpontokhoz.

 

A donor szűrés szempontjai

A Cornea Bank Budapest nemzetközileg kidolgozott és meghatározott módszertani, működési és minőségi protokollal rendelkezik, amely garantált minőséget biztosít a sebészeti beavatkozásokhoz biztosított szaruhártyáknál.
Olyan szövet, amely veszélyeztetheti a recipiens (és a cornea bank dolgozóinak) egészségét, nem kerülhet eltávolításra, tárolásra, és beültetésre. A szaruhártya transzplantáció előtti kontraindikációs lista a European Eye Bank Association (EEBA) mint nemzetközi szakmai szervezet ajánlását követve tartalmazza azokat a vírusos és baktériumos fertőzéseket, központi idegrendszeri rendellenességeket, malignus megbetegedéseket és szembetegségeket, melyek közül bármelyik megléte kizárja a cornea eltávolítás, tárolás és felhasználás lehetőségét.
A donor cornea vizsgálatát a Cornea Bank munkatársa végzi el a helyszínen még az eltávolítás előtt, és ezt figyelembe véve dönt annak alkalmasságáról. A vizsgálat során a szaruhártya általános állapotáról, az epithélium esetleges sérüléseiről, a stroma átlátszóságáról győződünk meg, és ezeket a megfelelő nyomtatványon is rögzítjük.
Itt már ki lehet szűrni egyes elváltozásokat, amelyek alkalmatlanná teszik a corneát beültetésre, így pl. keratoconus, homályok, ill. beszűrődések a stromában, neovascularizáció, pigmentszemcsék v. precipitátumok, pterygium, korábbi intraokuláris műtét nyoma, stb. Kóros elváltozást esetén a cornea eltávolításra sem kerül.
Ha hámhiány látható a corneán, az beültetésre még alkalmas lehet (a hiány mértéke alapján lehet dönteni az eltávolítás mellőzéséről). A tápoldatban történő tárolás során ugyanis néhány epithelsejt réteg rendszerint leválik, így a friss corneán levő 6-7 epithel rétegből egy 7-10 napos tárolás után már csak kb. 2-3 réteg marad meg. Az epithelsejtek hordozzák a HLA-A, B és C antigének legnagyobb részét a cornea egyes rétegei közül, így e rétegek számának csökkenése még a cornea átültetés utáni túlélését is javíthatja.
Az alkalmasnak ítélt szaruhártyák in situ corneaeltávolítás után a laboratóriumba kerülnek.

 

Szerológiai vizsgálatok

A nemzetközi és a magyar előírásoknak megfelelően a donorok hepatitisz B és C, HIV I/II és szifilisz (Treponema) szűrésen esnek át.
A vizsgálatok alapján átlagosan 3-4%-os a hepatitisz pozitivitás.
Bár HIV pozitivitás a vizsgálataink során eddig még nem fordult elő, a HIV szűrés jelentőségét abból a szempontból is szeretnénk hangsúlyozni, hogy bár még nem írták le AIDS betegség keratoplasztikával történő átvitelét, viszont HIV vírust könnyből, konjunktíváról, sőt corneáról is sikerült már izolálni.
Beültetésre csak negatív szerológiai eredményekkel rendelkező szaruhártyák kerülhetnek.

 

A cornea szövettani vizsgálata

A cornea laboratórium tevékenységének legfontosabb része magának a donor corneának a vizsgálata.
Az első vizsgálat a szövetek laboratóriumba érkezését követően, a második a tárolás végén, a műtétre való felkészítés előtt történik. Az endothéliumot inverz fénymikroszkóppal vizsgáljuk meg, melyhez kamera és számítógép van csatlakoztatva, így bármelyik szaruhártya endothéliumáról felvételeket készíthetünk és tárolhatunk.
Mikroszkóppal a cornea vastagságát, az epithéliumot, a Descemet redőket, az elhalt sejtek jelenlétét, és ami a legfontosabb, az endothelsejtek mennyiségét és mintázatát ellenőrizzük. Az endothelsejtek megfelelő száma, illetve minősége az egyik legfontosabb tényező a szaruhártya-átültetés sikerességében.
Az emberi szaruhártya endothelsejtjei nem képesek szaporodni - az élet során elpusztult sejtek helyét méretük növekedésével pótolják -, ezért az endothelsejtek vizsgálatakor igen fontos azok számának meghatározása. A tárolás során az endothelsejtek száma a tárolási idővel arányosan csökken. Ha az endolthelsejtek száma a négyzetmilliméterenkénti kb. 1500 alá csökken, a stroma már átlátszatlanná válik.
Miután az endothélium egész felszínét átvizsgáltuk százszoros nagyításon, a négyzetmilliméterenkénti sejtszám kiszámítása az okulár kalibrált rácshálózatának segítségével történik.

Minden beültetésre kerülő corneának a következő szövettani kritériumoknak kell megfelelnie:

• Minimálisan 2000 sejt/mm2 szükséges a mikroszkópos értékelések során.
• Maximum 1% elhalt sejt jelenléte elfogadható.
• Szabályos sejtmozaik (polymegathizmus vagy pleomorphizmus nélkül).
• A tárolás során történő duzzadás által okozott gyűrődéseken endothelsejtek jelenléte szükséges.
• Tiszta sejthatárok és világos megjelenés.
• Maximum 10%-os sejtveszteség a tárolás alatt.

 

Mikrobiológiai vizsgálat

Az évtizedes tapasztalatok eredményeképpen a szaruhártya laboratóriumokban a corneák tárolása során kötelező mikrobiológiai vizsgálatot végezni. A tápoldatos tárolás előnye, hogy az esetleges kontamináció a tárolás ideje alatt jól detektálható: az oldat elveszti áttetszőségét, és zavarossá válik.
Laboratóriumunkban minden cornea esetében mintavétel és mikrobiológiai vizsgálat történik a tárolóoldatból, így fertőzött szaruhártya beültetésre nem kerülhet ki.

 

Dokumentáció

A Cornea Bank Budapest nemzetközi mintára elkészített működési szabályzattal és minőségi protokollal rendelkezik, melyekben a működés minden részlete, így a dokumentáció kezelése is részletesen rögzített.
Minden vizsgálati eredményt papíron, illetve a saját fejlesztésű adatbázis és statisztikai programunkban is rögzítünk. Ezek az információk digitális formában tárolva vannak egészen Bank alapításáig visszamenően.

A szövettani és egyéb vizsgálatok eredményei a a szükséges egységes európai kóddal (SEC) együtt a törvényi előírásoknak megfelelően nyomtatott formában, a beültetésre kiadott corneával együtt jutnak el a transzplantációt végző intézménybe.